منصة الرسائل والاطاريح: التغاير في الشجرة الوراثية ل CRISPR و تسلسل الجينوم الكلي للسالمونيلا Salmonella entericaالمعزولة من عينات سريرية في محافظة بابل

الخلاصة

خلال فترة الدراسة تم جمع 200 عينة سريرية براز و دم ، عينات البراز تم اخذها من المرضى الذين يعانون من الاسهال المائي الذي يصاحبه احيانا مادة مخاطية او قيح او قليل من الدم وعينات الدم تم اخذها من مرضى التايفوئيد لكلا الجنسين ولكافة الاعمار. وكانوا المرضى من المراجعين الى المستشفيات الرئيسة في محافظة بابل هي: مستشفى الامام الصادق (ع) و مستشفى الحلة الجراحي التعليمي ومستشفى بابل التعليمي للنسائية والاطفال، خلال فترة اربعة اشهر (من شباط 2022 الى ايار 2022). بعد ذلك جرى زرع هذه العينات في وسط انتقائي تم تحديده من خلال استخدام فحوصات حيوية كيميائية وبكتريولوجية (نظام فيتك 2 المدمج)، وباستخدام بادئ خاص (SE1472298-2 لـلسالمونيلا انترايتدس ، STM4497 لـلسالمونيلا تايفيموريوم و O antigen synthesis tyv للسالمونيلا تايفي). من بين 200 عينة ، تم الكشف عن 34 (17٪) عزلة فقط من S. enterica عن طريق الزرع و نظام الفيتك 2 المضغوط. وبعد ذلك باستخدام جين خاص ، أظهرت النتائج أن 25 عزلة (73.53٪) فقط أعطت نتيجة موجبة لهذه الجينات تضمنت 13 (52)٪ من S. enteritidis ، و 6 (24)٪ من S. typhimurium و 6 (24)٪ من العزلات. S. typhi. وتم القيام باختبار التحسس للمضادات الحياتية عن طريق الفيتك 2 المدمج (نوع البطاقة AST GN76) للكشف عن الحساسية المكروبية ومقاومة عزلات السالمونيلا المعوية. وقد كانت المضادات الحياتية المستخدمة في هذه الدراسة حساسة للعزلات. حيث كانت العزلات حساسة بدرجة عالية للمضادات الحيوية ترايميثوبرين/ سالفاميثوكزازول، و امبنيم و تيكيسايكلن وبنسبة 100%، تتبعها المضادات بيبراسلين/تازوباكتام و سفيبيم و ارتابينيم بنسبة 96%،92%,92% على التوالي وايضا سفتازيديم و سفترياكزون بنسبة 82%. الا ان العزلات اظهرت معدل حساسية معتدلة (64%، 64%، 52%) تجاه الامبسلين والسبروفلوكساسين و النترفيورينشن، على التوالي. وكذلك اظهرت النتائج بان بعض العزلات كانت مقاومة بنسبة 88% للسيفازولين والسيفوكستين و الليفوفلوكساسين. كما ان العزلات كانت مقاوِمة للاميكاسين و الجنتيمايسين بنسبة مقاومة تصل الى 92%. وهذا يفسر بان هذه العقاقير لها نشاط جيد ضد السالمونيلا انتريكا ، لان اغلبها حساسة لهذه الادوية . وشملت الدراسة الكشف عن التنوع الجيني بين العزلات البكتيرية الذي تم من خلال استخدام (CRISPR)-PCR وتم تقييمها لاحتمال وجودها في 81 من عزلات السالمونيلا المعويه . تم إخضاع 18 من عزلات الأنماط المصلية للسالمونيلا المعوية المعزوله من عينات سريرية مختلفة (البراز و الدم) للكشف عن كريسبر 1 و 2 وقد أظهرت النتائج ان العزلات ال 18 (100٪) و 13 (72٪) كان PCR – موجب لكرسبر 1 و2 على التوالي. التكرار المباشر (DR) لعزلات كرسبر1 و كرسبر2 اظهرت طولا متطابقا 29 زوج قاعدي. أشار تعدد الأشكال ل DR لكرسبر 1 من خلال بناء شجرة النشوء والتطور إلى أن جميع الأنماط ال 18 يمكن تقسيمها إلى ستة خطوط (A-F) ، بينما من بين 13 نمطا متنوعا من كرسبر 2 يمكن تصنيفها إلى أربعة خطوط (A-D). كما تم إجراء قيمة التشابه الجيني للنمط المصلي للسالمونيلا المعوية وفقا لتسلسل التكرار لكرسبر 1 و كرسبر 2، وأظهرت النتائج أنه في كرسبر 1 هناك أقصى تشابه بين النمط المصلي بين SE11 و STM3 بنسبة (100٪) والحد الأدنى من التشابه بينSTM4 و STY29 بنسبة (40٪) ، بينما في كرسبر2 ، أقصى تشابه بين النمط المصلي SE11 و STY29 بنسبة (100٪) و الحد الأدنى من التشابه بين النمط المصلي SE7 و STM4 بنسبة (19٪). من ناحية أخرى ، اختلف اختبار كريسبر الموجود في السالمونيلا المعوية في الطول وتمت دراسة spacer أيضا وأظهرت النتيجة أن عدد spacer لكرسبر 1 كان بين 5-13 spacer وكرسبر 2 كان بين 1-12 spacer. ومع ذلك ، تم إجراء مقارنة محاذاة تسلسل لكرسبر 1 وكرسبر 2 spacer في السالمونيلا المعوية. تظهر شجرة النشوء والتطور التي تم إنشاؤها من محاذاة تسلسل كرسبر 1 spacer أن كل نمط مصلي تم تقسيمه إلى مجموعة. على عكس كرسبر 1 ، لم تتمكن شجرة النشوء والتطور التي تم إنشاؤها من محاذاة تسلسل كرسبر 2 spacer من التمييز بين الانماط المصلية للسالمونيلا المعوية . كما تمت دراسة قيمة التشابه الوراثي للسالمونيلا المعوية (السالمونلا تايفي والسالمونيلا تايفيموريم) وفقا لتسلسل spacer ل كرسبر 1 و كرسبر 2 ، وأظهرت النتيجة أنه في كرسبر 1 هناك أقصى تشابه بين STM26 و STM2 بنسبة (100٪) والحد الأدنى من التشابه بين SE6 و STY29 بنسبة (11%) ، بينما في كرسبر 2 أقصى تشابه بين الأنماط المصلية STM4 و SE7 ، STM4 و SE8 ، STY29 و SE11 بنسبة (100٪) والحد الأدنى من التشابه بين الأنماط المصلية STM26 و SE6 بنسبة (10٪). أظهرت دراستنا أيضا أنه في السيليكو PCR-RFLP من كريسبر ، أظهرت النتيجة أن تسلسل النوكليوتيدات ل كرسبر 1 و كرسبر 2 من الانماط المصلية للسالمونيلا المعوية الكشف عن تنوع كبير في عدد ونوكليوتيدات spacer وDR . تراوحت القطع من 2-330 زوج قاعدي في كرسبر1 ، بينما تراوحت القطع من 3-375 زوج قاعدي في كرسبر 2. على المستوى الجينومي ، حاولت هذه الدراسة التمييز بين السلالات ذات الصلة ، السالمونيلا المعوية subsp. enterica serovar Typhimurium (STY9) والسالمونيلا المعوية subsp. enterica serovar Typhi (SalT33) ، باستخدام تسلسل الجينوم الكامل. لاحظت نتائج هذه الدراسة أن كروموسومات (STY9) و SalT33)) هي اختلافات طفيفة جدا ، حيث كان الحجم الجيني ل STY9 4687295 bp) ، 52.2٪ GC ) أكبر من جينوم SalT33 4679911 bp) ، 52.12% GC). بعد تحليل الجينوم المقارن ، أظهرت جميع الجينومات المدروسة ل STY9) و SalT33) أنماطا مختلفة من الأحداث التطورية (إعادة ترتيب الجينوم والكسب أو الخسارة المجزأة) مع بعضها البعض أو مع الجينوم المرجعي . بالإضافة إلى ذلك ، تمت دراسة تشابه تسلسل الانماط المصلية للسالمونيلا المعوية بالمقارنة مع الجينوم المرجعي ، وكشفت نتيجة هذه الدراسة أن تشابه التسلسل في سلالة SalT33 كان أعلى من سلالة STY9 ، حيث يحتوي STY9 على فجوات أكثر من SalT33 بعد شرح هذه الجينومات ، أبلغت هذه الدراسة عن وجود (4701CDS ، 38 tRNA و 3 rRNA و 521 بروتين افتراضي) في جينوم STY9 بينما( 4855 CDS ، 68 tRNA ، 4 rRNA و 530 بروتين افتراضي) في جينوم SalT33. تم شرح جميع بروتينات النظام الفرعي والبروتينات المتخصصة (الجينات المقاومة للمضادات الحيوية ، أهداف الدواء ، الناقلات وعوامل الفوعة) في هذه الدراسة ، حيث كان هناك اختلاف طفيف بين STY9 و SalT33. وبالتالي ، تم تحديد البديل الذي يستدعي الانماط المصلية للسالمونيلا المعوية (STY9 و SalT33) بالمقارنة مع الجينوم المرجعي. وفقا للمتغيرات ، أظهر عدد الجينومات المدروسة وجود (25608) متغيرا شمل 99.01٪ (25355) SNPs و 0.53٪ (134) إدخال و 0.46٪ (119) حذف في جينوم STY9 و (680)متغيرا شمل 93.97٪ (639) SNPs ، 2.95٪ (20) إدخال و 3.08٪ (21) حذف في جينوم SalT33. في المقابل ، تم حساب عدد التغيير الأساسي على كل SNPs لتحديد نوع اختلاف التسلسل. أظهرت جميع الجينومات المدروسة أنماط تباين التشابه ، حيث كانت الأنماط الأكثر شيوعا لاستبدال القاعدة هي بدائل C ↔ T و G ↔ A. تمثل هذه الأنماط استبدال الانتقال بدلا من استبدال التحويل في جميع الجينومات المدروسة بعد SNPs. في الختام ، توفر نتائج هذه الدراسة إطارا شاملا لعمل الجينوم الكامل للانماط المصلية للسالمونيلا المعوية. خلال فترة الدراسة تم جمع 200 عينة سريرية براز و دم ، عينات البراز تم اخذها من المرضى الذين يعانون من الاسهال المائي الذي يصاحبه احيانا مادة مخاطية او قيح او قليل من الدم وعينات الدم تم اخذها من مرضى التايفوئيد لكلا الجنسين ولكافة الاعمار. وكانوا المرضى من المراجعين الى المستشفيات الرئيسة في محافظة بابل هي: مستشفى الامام الصادق (ع) و مستشفى الحلة الجراحي التعليمي ومستشفى بابل التعليمي للنسائية والاطفال، خلال فترة اربعة اشهر (من شباط 2022 الى ايار 2022). بعد ذلك جرى زرع هذه العينات في وسط انتقائي تم تحديده من خلال استخدام فحوصات حيوية كيميائية وبكتريولوجية (نظام فيتك 2 المدمج)، وباستخدام بادئ خاص (SE1472298-2 لـلسالمونيلا انترايتدس ، STM4497 لـلسالمونيلا تايفيموريوم و O antigen synthesis tyv للسالمونيلا تايفي). من بين 200 عينة ، تم الكشف عن 34 (17٪) عزلة فقط من S. enterica عن طريق الزرع و نظام الفيتك 2 المضغوط. وبعد ذلك باستخدام جين خاص ، أظهرت النتائج أن 25 عزلة (73.53٪) فقط أعطت نتيجة موجبة لهذه الجينات تضمنت 13 (52)٪ من S. enteritidis ، و 6 (24)٪ من S. typhimurium و 6 (24)٪ من العزلات. S. typhi. وتم القيام باختبار التحسس للمضادات الحياتية عن طريق الفيتك 2 المدمج (نوع البطاقة AST GN76) للكشف عن الحساسية المكروبية ومقاومة عزلات السالمونيلا المعوية. وقد كانت المضادات الحياتية المستخدمة في هذه الدراسة حساسة للعزلات. حيث كانت العزلات حساسة بدرجة عالية للمضادات الحيوية ترايميثوبرين/ سالفاميثوكزازول، و امبنيم و تيكيسايكلن وبنسبة 100%، تتبعها المضادات بيبراسلين/تازوباكتام و سفيبيم و ارتابينيم بنسبة 96%،92%,92% على التوالي وايضا سفتازيديم و سفترياكزون بنسبة 82%. الا ان العزلات اظهرت معدل حساسية معتدلة (64%، 64%، 52%) تجاه الامبسلين والسبروفلوكساسين و النترفيورينشن، على التوالي. وكذلك اظهرت النتائج بان بعض العزلات كانت مقاومة بنسبة 88% للسيفازولين والسيفوكستين و الليفوفلوكساسين. كما ان العزلات كانت مقاوِمة للاميكاسين و الجنتيمايسين بنسبة مقاومة تصل الى 92%. وهذا يفسر بان هذه العقاقير لها نشاط جيد ضد السالمونيلا انتريكا ، لان اغلبها حساسة لهذه الادوية . وشملت الدراسة الكشف عن التنوع الجيني بين العزلات البكتيرية الذي تم من خلال استخدام (CRISPR)-PCR وتم تقييمها لاحتمال وجودها في 81 من عزلات السالمونيلا المعويه . تم إخضاع 18 من عزلات الأنماط المصلية للسالمونيلا المعوية المعزوله من عينات سريرية مختلفة (البراز و الدم) للكشف عن كريسبر 1 و 2 وقد أظهرت النتائج ان العزلات ال 18 (100٪) و 13 (72٪) كان PCR – موجب لكرسبر 1 و2 على التوالي. التكرار المباشر (DR) لعزلات كرسبر1 و كرسبر2 اظهرت طولا متطابقا 29 زوج قاعدي. أشار تعدد الأشكال ل DR لكرسبر 1 من خلال بناء شجرة النشوء والتطور إلى أن جميع الأنماط ال 18 يمكن تقسيمها إلى ستة خطوط (A-F) ، بينما من بين 13 نمطا متنوعا من كرسبر 2 يمكن تصنيفها إلى أربعة خطوط (A-D). كما تم إجراء قيمة التشابه الجيني للنمط المصلي للسالمونيلا المعوية وفقا لتسلسل التكرار لكرسبر 1 و كرسبر 2، وأظهرت النتائج أنه في كرسبر 1 هناك أقصى تشابه بين النمط المصلي بين SE11 و STM3 بنسبة (100٪) والحد الأدنى من التشابه بينSTM4 و STY29 بنسبة (40٪) ، بينما في كرسبر2 ، أقصى تشابه بين النمط المصلي SE11 و STY29 بنسبة (100٪) و الحد الأدنى من التشابه بين النمط المصلي SE7 و STM4 بنسبة (19٪). من ناحية أخرى ، اختلف اختبار كريسبر الموجود في السالمونيلا المعوية في الطول وتمت دراسة spacer أيضا وأظهرت النتيجة أن عدد spacer لكرسبر 1 كان بين 5-13 spacer وكرسبر 2 كان بين 1-12 spacer. ومع ذلك ، تم إجراء مقارنة محاذاة تسلسل لكرسبر 1 وكرسبر 2 spacer في السالمونيلا المعوية. تظهر شجرة النشوء والتطور التي تم إنشاؤها من محاذاة تسلسل كرسبر 1 spacer أن كل نمط مصلي تم تقسيمه إلى مجموعة. على عكس كرسبر 1 ، لم تتمكن شجرة النشوء والتطور التي تم إنشاؤها من محاذاة تسلسل كرسبر 2 spacer من التمييز بين الانماط المصلية للسالمونيلا المعوية . كما تمت دراسة قيمة التشابه الوراثي للسالمونيلا المعوية (السالمونلا تايفي والسالمونيلا تايفيموريم) وفقا لتسلسل spacer ل كرسبر 1 و كرسبر 2 ، وأظهرت النتيجة أنه في كرسبر 1 هناك أقصى تشابه بين STM26 و STM2 بنسبة (100٪) والحد الأدنى من التشابه بين SE6 و STY29 بنسبة (11%) ، بينما في كرسبر 2 أقصى تشابه بين الأنماط المصلية STM4 و SE7 ، STM4 و SE8 ، STY29 و SE11 بنسبة (100٪) والحد الأدنى من التشابه بين الأنماط المصلية STM26 و SE6 بنسبة (10٪). أظهرت دراستنا أيضا أنه في السيليكو PCR-RFLP من كريسبر ، أظهرت النتيجة أن تسلسل النوكليوتيدات ل كرسبر 1 و كرسبر 2 من الانماط المصلية للسالمونيلا المعوية الكشف عن تنوع كبير في عدد ونوكليوتيدات spacer وDR . تراوحت القطع من 2-330 زوج قاعدي في كرسبر1 ، بينما تراوحت القطع من 3-375 زوج قاعدي في كرسبر 2. على المستوى الجينومي ، حاولت هذه الدراسة التمييز بين السلالات ذات الصلة ، السالمونيلا المعوية subsp. enterica serovar Typhimurium (STY9) والسالمونيلا المعوية subsp. enterica serovar Typhi (SalT33) ، باستخدام تسلسل الجينوم الكامل. لاحظت نتائج هذه الدراسة أن كروموسومات (STY9) و SalT33)) هي اختلافات طفيفة جدا ، حيث كان الحجم الجيني ل STY9 4687295 bp) ، 52.2٪ GC ) أكبر من جينوم SalT33 4679911 bp) ، 52.12% GC). بعد تحليل الجينوم المقارن ، أظهرت جميع الجينومات المدروسة ل STY9) و SalT33) أنماطا مختلفة من الأحداث التطورية (إعادة ترتيب الجينوم والكسب أو الخسارة المجزأة) مع بعضها البعض أو مع الجينوم المرجعي . بالإضافة إلى ذلك ، تمت دراسة تشابه تسلسل الانماط المصلية للسالمونيلا المعوية بالمقارنة مع الجينوم المرجعي ، وكشفت نتيجة هذه الدراسة أن تشابه التسلسل في سلالة SalT33 كان أعلى من سلالة STY9 ، حيث يحتوي STY9 على فجوات أكثر من SalT33 بعد شرح هذه الجينومات ، أبلغت هذه الدراسة عن وجود (4701CDS ، 38 tRNA و 3 rRNA و 521 بروتين افتراضي) في جينوم STY9 بينما( 4855 CDS ، 68 tRNA ، 4 rRNA و 530 بروتين افتراضي) في جينوم SalT33. تم شرح جميع بروتينات النظام الفرعي والبروتينات المتخصصة (الجينات المقاومة للمضادات الحيوية ، أهداف الدواء ، الناقلات وعوامل الفوعة) في هذه الدراسة ، حيث كان هناك اختلاف طفيف بين STY9 و SalT33. وبالتالي ، تم تحديد البديل الذي يستدعي الانماط المصلية للسالمونيلا المعوية (STY9 و SalT33) بالمقارنة مع الجينوم المرجعي. وفقا للمتغيرات ، أظهر عدد الجينومات المدروسة وجود (25608) متغيرا شمل 99.01٪ (25355) SNPs و 0.53٪ (134) إدخال و 0.46٪ (119) حذف في جينوم STY9 و (680)متغيرا شمل 93.97٪ (639) SNPs ، 2.95٪ (20) إدخال و 3.08٪ (21) حذف في جينوم SalT33. في المقابل ، تم حساب عدد التغيير الأساسي على كل SNPs لتحديد نوع اختلاف التسلسل. أظهرت جميع الجينومات المدروسة أنماط تباين التشابه ، حيث كانت الأنماط الأكثر شيوعا لاستبدال القاعدة هي بدائل C ↔ T و G ↔ A. تمثل هذه الأنماط استبدال الانتقال بدلا من استبدال التحويل في جميع الجينومات المدروسة بعد SNPs. في الختام ، توفر نتائج هذه الدراسة إطارا شاملا لعمل الجينوم الكامل للانماط المصلية للسالمونيلا المعوية.